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Optimierung des Comet Assay für den Einsatz im Biomonitoring

Volltext

Beschreibung

Der Comet Assay (Einzelzellgelelektrophorese) ist als in vitro- und in vivo-Genotoxizitätstest weitgehend akzeptiert. Da gezeigt werden konnte, dass der Comet Assay sehr empfindlich verschiedene Arten von DNA-Schäden in eukaryoten Zellen nach Behandlung mit genotoxischen Agenzien nachweist und sehr einfach durchzuführen ist, wird diese Methode auch zunehmend im Rahmen des "Human Biomonitoring" eingesetzt. Jedoch wird die Bewertung kleiner Effekte, wie sie im Biomonitoring typischerweise auftreten, dadurch eingeschränkt, dass der Test eine hohe Variabilität aufweist und ein optimales Protokoll mit hoher Sensitivität für das Biomonitoring bisher nicht etabliert wurde. Wir haben im Rahmen dieses Projektes umfangreiche Untersuchungen an Blutproben von Rauchern und Nichtrauchern durchgeführt. Raucher stellen eine geeignete Gruppe zum Nachweis genotoxischer Effekte durch Umweltmutagene dar, da der Tabakrauch zahlreiche potenziell mutagene und kanzerogene Stoffe enthält. Für die Probandenauswahl haben wir stringente Kriterien definiert. Als Maßnahme der Qualitätssicherung wurden verschieden interne und externe Kontrollen durchgeführt. Über in vitro-Tests wurde die Sensitivität das Comet Assay Protokolls definiert und es wurde untersucht, ob durch die Kombination des Standard Comet Assays mit dem FPG-Protein (Formamidopyrimidin-Glycosylase) zum Nachweis spezifischer DNA-Basenschäden und mit dem Reparaturinhibitor Aphidicolin (APC) die Sensitivität des Tests erhöht werden kann. Im Verlauf unserer Experimente wurden dann vergleichende Untersuchungen an Vollblut und isolierten Lymphozyten in An- und Abwesenheit von APC oder dem FPG-Protein durchgeführt. Neben möglichen Unterschieden in basalen DNA-Schäden wurden Raucher und Nichtraucher vergleichend im Hinblick auf ihre Mutagensensitivität und ihre Reparaturkapazität untersucht. Schließlich wurde der Frage nachgegangen, ob bestimmte genetische Polymorphismen in Genen des Fremdstoffmetabolismus und der DNA-Reparatur die Ergebnisse des Comet Assays bei Rauchern und Nichtrauchern beeinflussen. In keinem dieser Ansätze konnte ein eindeutiger Unterschied zwischen Rauchern und Nichtrauchern festgestellt werden. Unser Projekt hat gezeigt, dass sich ein genotoxischer Effekt des Rauchens mit dem Comet Assay nicht eindeutig nachweisen lässt. Die Ergebnisse zeigen, dass an Biomonitoring-Studien mit dem Comet Assay hohe Qualitätsanforderungen zu stellen sind und weisen auf offensichtliche Schwächen des Comet Assays zum Nachweis genotoxischer Effekte in peripherem Blut hin. Unser Projekt konnte einige konkrete Punkte aufzeigen, die in zukünftige "Guidelines" für den Comet Assay einfließen sollten.

Metadaten

TitelOptimierung des Comet Assay für den Einsatz im Biomonitoring 
Stand 2005 
Seitenzahl26 
Förderkennzeichen BWB21001

 

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