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Regulative Mechanismen der Genexpression intrazellulärer NO-Synthase in bronchoepithelialen Zellen in vivo und in vitro nach Exposition mit faser- und partikelförmigen Stäuben

Volltext

Beschreibung

Einleitung/Ziele: NO (Stickstoffmonoxid) ist ein zelluläres Produkt und in der humanen Lunge bei Entzündungsprozessen vermehrt nachweisbar (z.B. Asthma bronchiale, Bronchiektasen). Da die vermehrte Oxidantienfreisetzung als ein wesentlicher proinflammatorischer Mechanismus bei staubinduzierten Lungenerkrankungen (z.B. Asbestose) angesehen wird, sollte in diesem Projekt die Frage geklärt werden, ob prooxidativ wirkende Stäube (Krokydolithasbest, Quarz) in Bronchialzellen und/oder in Alveolarmakrophagen (AM) zu einer Steigerung der zellulären NO-Produktion führen.

Studiendesign/Methodik: Das Forschungsvorhaben gliederte sich in einen in vitro und in einen ex vivo Abschnitt. In vitro wurden an verschiedenen Zellinien (A549, BEAS 2B) untersucht, ob und unter welchen Bedingungen sie NO produzieren (Griess-Reagenz) und ob die NO-Produktion mit der Induktion der zellulären iNOS (inducible NO-synthase) korreliert. Da vorwiegend A549-Zellen zur NO-Produktion in der Lage sind, wurde auf die Expositionsversuche von BEAS 2B-Zellen verzichtet. Folgende Untersuchungen wurden durchgeführt::

  1. Quantifizierung der NO-Produktion (Griess-Reagenz) und iNOS Expression (Northern Blot-Analysen) vor und nach Stimulation mit Zytokinen (Tumornekrosefaktor-alpha [TNF-a ], Interleukin-1ß [IL-1ß], Interferon-gamma [IFN-g ], je 10 ng/ml), Krokydolith und Quarz (Negativkontrolle: Latexpartikel);
  2. Quantifizierung der NO-Produktion und Evaluierung deren Stimulierbarkeit in AM (gewonnen an Patienten mit pulmonalem Rundherd, n =30);
  3. Detektion der iNOS mRNA (in situ Hybridisierung) in Bronchialschleimhautbiopsien (Raucher-/Nichtraucher; staubexponierte/nichtstaubexponierte Patienten; n=19);
  4. Quantifizierung der NO-Produktion von A549-Zellen unter Koinkubation des Kulturüberstandes stimulierter (Krokydolith) AM (Kontrollen: L-NAME, entsprechende Zytokinantikörper.
  5. Quantifizierung von TNF-a und IL-1ß in AM-Überständen (ELISA).

Ergebnisse: Die zelluläre NO-Freisetzung war am effektivsten in der Zellinie A549 durch die kombinierte Gaben von TNF-a , IFN-g und IL-1ß induzierbar. Die NO-Synthese verhielt sich wie folgt (vor und nach Zytokinstimulation): basal 6,1± 3,2; unter Stimulation 20,7± 10,3 *10-6 mol/l/mg Protein (p<0,001). Die Inkubation mit nicht-zelltoxischen (LDH release Assay) Konzentrationen von Krokydolithasbest und Quarz (1-8µg/cm2, Inkubationszeiten: 8, 24, 48 h) hatte keinen Effekt auf die NO-Produktion. Parallel konnte der iNOS mRNA-Nachweis geführt werden. Mittels bronchoalveolärer Lavage gewonnene AM sezernieren ebenfalls NO. Allerdings ist NO-Produktion nicht steigerbar (weder durch die o.g. Zytokine noch durch eine Staubexposition [1-8µg/cm2, Inkubationszeiten: 8, 24, 48 h] oder Lipopolysaccaride): Werte um 1,8± 10-6 mol/l/mg Protein. In den Bronchialschleimhautbiopsien ließ sich iNOS mRNA überwiegend im Bronchialepithel nachweisen. Staubexponierte Patienten (Asbest, Kohlemischstäube) zeigten überproportional (8 von 10 Patienten) häufiger, nichtstaubexponierte Probanden dagegen kaum (2 von 9 Patienten) positive Signale in den Biopsien. Eine Abhängigkeit zum Raucherstatus ergab sich nicht. Zur Überprüfung der Hypothese einer möglichen Interaktion zwischen AM und bronchoepithelialen Zellen wurde der Überstand LPS-stimulierter AM A549-Zellen zugegeben. Dadurch ließ sich die NO-Produktion signifikant erhöhen: basal 5,66± 0,64; unter Stimulation 16,80± 1,13 *10-6 mol/l/mg Protein (p<0,01). Eine Vorinkubation der AM mit Krokydolith-Asbest (8 µg/cm2, 24 h) erbrachte keine zusätzliche Steigerung. Der Grund liegt in der mangelnden zusätzlichen Steigerung der Zytokinantwort, da TNF-a und IL-1ß trotz der Staubexposition nicht zusätzlich sezerniert wurde. Die Koinkubation mit den Antikörpern anti-TNF-a , -IL-1ß und -IFN-g und die Gabe des spezifischen iNOS-Inhibitors L-NAME unterdrückte die vormalig erhöhte NO-Produktion von A549-Zellen.

Zusammenfassung:

  1. Das Bronchialepithel ist der wesentliche Ursprungsort zellulärer NO-Freisetzung der tieferen Atemwege. Die NO-Produktion von A549-Zellen ist durch Zytokine (TNF-a , IL-1ß und IFN-g ) nicht jedoch durch Stäube (Krokydolith, Quarz) steigerbar.
  2. AM produzieren NO. Die NO-Freisetzung ist jedoch weder durch Zytokine noch durch Stäube zusätzlich stimulierbar.
  3. AM produzieren die für die NO-Produktion der bronchoepithelialen Zellen notwendigen Zytokine. Es konnte die Interaktion der beiden nach inhalativer Fremdstoffbelastung primär bedeutungsvollen Zelltypen (bronchoepitheliale Zellen, AM) anhand der zellulären NO-Freisetzung nachgewiesen.
  4. Die iNOS wird überwiegend in Bronchialepithelzellen exprimiert, wobei in vivo eine Staubexposition unabhängig vom Raucherstatus eine vermehrte Expression zu begünstigen scheint.

Metadaten

TitelRegulative Mechanismen der Genexpression intrazellulärer NO-Synthase in bronchoepithelialen Zellen in vivo und in vitro nach Exposition mit faser- und partikelförmigen Stäuben 
Stand 2000 
Seitenzahl26 
Förderkennzeichen PUGL97004

 

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