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Untersuchung der zellulären Wirkung von Ozon: Entwicklung einer nicht-invasiven Methode zum Nachweis oxidativ veränderter DNA-Basen

Volltext

Beschreibung

Unter der Fragestellung, ob Ozon bei Inhalation umweltrelevanter Konzentrationen in der Lage ist, oxidativen Streß und damit oxidierte DNA Basen zu verursachen, sollte ein neues Nachweisverfahren für oxidierte DNA Basen, insbesondere especially 8-Oxo-7,8-dihydro-2?-desoxyguanosine (8-oxodG), entwickelt werden. Dies sollte basierend auf der "matrix assisted laser desorption ionisation time of flight mass spectrometry" ("MALDI-TOF" MS) sowohl die Identifikation als auch die Quantifizierung des Analyten erlauben. Aus dem Potential von Ozon, oxidativen Streß zu verursachen und oxidierte DNA-Basen zu induzieren, welche Mutationen verursachen können und damit potentiell Krebs verursachen können, sollte eine Aussage über dessen Gentoxizität unter umweltrelevanten Bedingungen getroffen werden.

Im Rahmen von Vorversuchen wurden HL60 Zellen gegenüber verschiedenen Ozonkonzentrationen exponiert. Durch den mit FPG-Protein modifizierten Comet-Assay konnten ab einer Konzentration von 8 mg/m³ und einer Expositionszeit von 30 min eine Zunahme der DNA-Strangbrüche und der FPG-sensitiven Läsionen beobachtet werden. Daß der Effekt erst bei relativ hohen, nicht umweltrelevanten Konzentrationen auftritt, liegt an der geringen Empfindlichkeit dieser Zellinie gegenüber oxidativer Schädigung, wie durch weitere Untersuchungen nachgewiesen werden konnte. Ferner wurde ein Schadensprofil durch Einsatz verschiedener Reparaturenzyme im Plasmid-Relaxation-Assay für die Ozonschädigung an isolierter Plasmid-DNA aufgenommen. Hier überweigt die Bildung FPG- und Endonuklease-III sensitiver Läsionen. Ein solches Schadensprofil wurde bisher durch keinen anderen oxidativen Einfluß beobachtet. Durch weitere Untersuchungen ließe sich hieraus ein Einblick in die mechanistischen Aspekte der Ozonreaktion mit DNA gewinnen. Ebenfalls wurden die Zeit- und Konzentrationsabhängigkeit des Effekts überprüft.

Zum massenspektrometrischen Nachweis von 8-oxodG aus Urin war es nötig, zunächst den Analyten aufzukonzentrieren und zu reinigen. Hierzu mußte eine neue Immunoaffinitätschromatographie entwickelt, da die in der Literatur beschriebene nicht verwendet werden konnte. Unter Verwendung eines neuen Aufreinigungsverfahren zur Isolierung des monoklonalen Antikörpers 1F7 aus Zellkulturüberstand war es möglich, Immunoaffinitätssäulen mit hoher Kapazität und Spezifität herzustellen. Die immunoaffinitätschromtographische Aufreinigung wurde validiert und die Wiederfindung mit 85 % bestimmt.

Bei der Entwicklung der MALDI-TOF MS Methode mußte zunächst die Fragmentierung des Analyten, die zwar einerseits eine zusätzliches Identifikation erlaubt, aber andererseits die Nachweisgrenze verschlechtert, unterdrückt werden. Dies gelang durch Verwendung von 2-Hydroxy-5-methoxybenzoesäure als Matrixmaterial und einen schichtförmigen Matrixaufbau (Laminat Matrix ? Probe ? Matrix). Hiermit konnte die Nachweisgrenze für synthetischen 8-oxodG Standard auf ca. 1 pmol gesenkt werden. Allerdings erhöhte sich die Nachweisgrenze nach Immunoaffinitätschromatographie durch zusätzliche Matrixeffekte auf über 5 pmol, so daß das Verfahren zur Messung von Urinproben unter den gegenwärtigen apparativen Bedingungen nicht empfindlich genug ist. Da das Verfahren jedoch eine gute Korrelation mit Vergleichsmethoden (HPLC mit elektrochemischer Detektion zeigt) (R² = 0,90), beinhaltet es noch ein großes Entwicklungpotential.

Als Vergleichsmethode wurde ein HPLC-Verfahren mit elektrochemischer Detektion zur Analyse von immunoaffinitätsaufgereinigtem Urin entwickelt. Unter Verwendung von Gradientenelution konnten zwei dicht beieinander eluierende, elektrochemisch aktive Peaks getrennt werden. Der erste wurde anhand seiner Retentionszeit und seines hydrodynamischen Voltammogramms als 8-oxodG idenfiziert.

Zum Nachweis von 8-oxodG in lymphozytärer DNA wurde ein Verfahren entwickelt, welche die Artefaktbildung minimiert und eine exakte Quantifizierung des Analyten zuläßt. Dies erfolgt durch HPLC mit elektrochemischer Detektion nachdem die DNA unter Verwendung eines speziellen Isolierungs- und Hydrolyseverfahrens aufbereitet wurde. Die gemessenen Werte lagen in der Größenordungen 10 ? 100 8-oxodG / 108 dG.

Im Rahmen der tierexperimentellen Arbeiten wurden vier Gruppen von je 8 männlichen Fischer F344-Ratten nach der Methode der "nose-only"-Applikation 1.5 Stunden pro Tag gegenüber Ozonkonzentrationen von 30 ? 50 (Raumluft), 200, 500 und 1000 µg/m³ exponiert. Wöchentlich wurde 24-h Urin gesammelt, vierzehntägig wurden Blutproben entnommen.

Die gesammelten Proben werden zur Zeit auf den 8-oxodG-Gehalt in lymphozytärer DNA und im Urin analysiert.

Metadaten

TitelUntersuchung der zellulären Wirkung von Ozon: Entwicklung einer nicht-invasiven Methode zum Nachweis oxidativ veränderter DNA-Basen 
Stand 1999 
Seitenzahl41 
Förderkennzeichen PUGL96003

 

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